Fluorescenčna mikroskopija: načela metode

Absorpcija in ponovnega oddajanja svetlobe nadaljnje anorganske in organske tekočine je posledica fosforescenco ali fluorescence. Razlika med pojavov je trajanje intervala med absorpcijo in emisijo svetlobni tok. Ko fluorescenca teh procesov se pojavijo skoraj istočasno, medtem ko fosforescenco - z nekaj zamude.

zgodovinski podatki

Leta 1852, britanski znanstvenik Stokes, prvi opisal fluorescence. On je uvedel nov pojem kot posledica poskusov z fluorita, ki oddajajo rdečo svetlobo pod ultravijolično svetlobo. Stokes omeniti zanimiv pojav. To je bilo ugotovljeno, da je valovna dolžina fluorescentnega sevanja vedno večji od toka svetlobe vzbujanja.

Za potrditev hipoteze v 19. stoletju je bilo veliko poskusov. Pokazali so, da različne vzorce fluorescirajo pod vplivom ultravijolične svetlobe. Med materiali, med drugim bili kristali, smole, mineralov, klorofila, surova droge, anorganskih spojin, vitaminov, olja. Neposredna uporaba barvil za biološke teste začela šele leta 1930

Fluorescenčna mikroskopija: Opis

Nekateri od uporabljenih materialov v prvi polovici študij 20. stoletja razstavljeni visoko specifičnost. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Hvala za uspešnost, ki jih ni bilo mogoče doseči z kontrastne metode, je metoda fluorescenčno mikroskopijo postalo nepogrešljivo orodje v biomedicinskih in biološke raziskave. Prav tako so bili pridobljeni pomembni rezultati, in za materiale.

? Kakšne koristi način fluorescenčno mikroskopijo? Z uporabo novih materialov je postalo mogoče in izbor zelo specifičnih celičnih Izredno majhnih komponent. Fluorescenčna mikroskopija lahko zazna posamezne molekule. Različnih barv omogočajo identifikacijo več predmetov naenkrat. Kljub omejenim prostorsko ločljivostjo mejo difrakcije opreme, ki v zameno, je odvisno od specifične lastnosti vzorca, je povsem mogoče, tudi identifikacija molekul pod to raven. Različne vzorce po obsevanju razstavljanje avtofluorescenco. Ta pojav se pogosto uporablja v petrologije, botanike, polprevodniški industriji.

lastnosti

Študija živalskih tkiv ali patogenov pogosto zapletenih ali preveč šibke ali zelo močne nespecifična avtofluorescenco. Vendar vrednost v študijah pridobi vnos komponent materiala vzbuja pri določeni valovni dolžini in oddajajo potrebno intenzivnost svetlobe toka. Fluorokromi delujejo kot barvila, ki lahko neodvisno vezana konstrukciji (vidnih ali nevidnih). Tako imajo visoko selektivnost za tarčo, in kvantni izkoristek.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescenčna mikroskopija je bil široko uporablja od takrat naravnih in sintetičnih barvil. So jih imeli določene profile intenzivnost emisij in vzbujanja in usmerjene na specifične biološke cilje.

Identifikacija posameznih molekul

Pogosto, v idealnih pogojih, se lahko registrirate ločen element sijaj. Za to, med drugim, da je treba zagotoviti dovolj nizko raven hrupa detektorja in optični ozadju. Fluorescein molekula na neuspeh zaradi fotobeljenje lahko oddaja do 300 tisoč. Fotoni. Na 20% učinkovitost zbiranja procesa in jih lahko registrira v višini okoli 60 tisoč evrov.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na plazov fotodiod ali elektronski razmnoževanje, dovoljeno raziskovalci opazovati obnašanje posameznih molekul skozi drugo, in v nekaterih primerih celo minut.

kompleksnost

Ključno vprašanje v prid ukinitve optičnega šuma. Glede na to, da je veliko materialov, ki se uporabljajo pri načrtovanju filtrov in leč kažejo nekaj avtofluorescenco, prizadevanja znanstvenikov v zgodnjih fazah so bile usmerjene v proizvodnjo sestavnih delov, ki imajo nizko fluorescence. Vendar pa so kasnejše poskusi pripeljala do novih sklepov. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Zlasti je bilo ugotovljeno, da fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na skupnem notranjem razmisleku, saj omogoča, da se doseže nizko ozadje in visoke intenzivnosti vzbujanja svetlobo.

mehanizem

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Načela fluorescenčno mikroskopijo, ki temelji na skupnem notranjem razmisleku je uporaba evanescentni val ali evanescentni. To se zgodi na meji med mediji z različnimi lomnega količnika. V tem primeru je svetlobni žarek skozi prizmo. Ima visok lomni parameter.

Prizma mejijo na vodni raztopini ali steklo z nizkim parametrom. Če žarek svetlobe usmerjen na to, pod kotom, ki je bolj kritično, je žarek popolnoma odbija od vmesnika. Ta pojav, po drugi strani povzroča nonpropagating valove. Z drugimi besedami, ustvari elektromagnetno polje, ki prodre v mediju z nižjo lomnega količnika parameter na razdalji manj kot 200 nanometrov.

Kratkotrajan val Svetilnost bi bilo dovolj za vzbujanje fluorofori. Vendar pa je zaradi svoje izredno majhne globine, se bo njegov obseg zelo majhen. Rezultat je ozadje nizko raven.

sprememba

Fluorescenčna mikroskopija temelji na skupni notranji razmislek, se lahko izvajajo z epi-osvetlitvijo. To zahteva leče z visoko numerično aperturo (vsaj 1,4, vendar je zaželeno, da je dosegla 1,45-1,6), in delno osvetljeno polje aparat. To se dosega z majhno velikostjo kraju samem. Za boljše poenotenje s tanko obroč, ki je blokirana z delom toka. Za kritično kotom, po katerem pride do popolnega odboja, potrebujemo visoko stopnjo refrakcije s potopno medija v objektivu in zaščitnega stekla mikroskopa.