Molekularna metoda genetske raziskave

Za raziskovanje in identifikacijo variant v strukturi DNA, ki se uporabljajo genske metode molekularne. Za vsako regijo DNA, ki raziskuje tej regiji kromosomov, gena ali alel, metode razlikujejo. Osnova vsake genetske metode molekularne obsega del ali drugi manipulaciji RNK in DNK. Vse te metode so značilna ogromno kompleksnosti, brez laboratorijske pogoji ne more izvesti, in osebje, ki mora biti visoko usposobljeni. To delo poteka v več fazah.

faze

Prvič, za RNA ali DNA vzorci proizvedeni. Tu lahko genetski metode molekularne se uporablja za praktično vsak material: kapljico krvi, levkocitov, fibroblasti kulture, sluznico (nepotrebno), celo lasnih mešičkov, - DNA lahko dobimo iz vsakega vzorca. Primeren je za uporabo kakršnih koli molekularno genetske metode in njihove različne možnosti in so se dolgo izolirali DNK shranjeni zamrznjeni. Druga stopnja je namenjen kopičenju želenimi fragmentov (pomnoževanje) DNA, saj pomaga zagotoviti polimerazne verižne reakcije in vitro (in vitro brez udeležbe živem organizmu). Kot rezultat, izbrane fragment DNA množi s tem verižno reakcijo, in znesek povečanja DNA dobesedno milijone krat.

Tretji korak v molekularnih metod genetskega raziskovalnih Predpostavlja pomnoženo omejitev DNA (to razdrobljenost, trganje ali rezanje). Omejitev z elektroforezo izvaja na poliakrilamidnem ali agaroznem gelu. Ta molekularno genetsko Postopek po študiju fragmenta DNA omogoča vsem vzeti določen položaj v gelu. Zatem je gel obdelamo z etidijevim bromidom, ki je sposobna vezave na DNA, obsevanje z ultravijolično svetlobo, potem je mogoče opazovati luminiscence odseke. Molekularne genetske diagnostične metode so različne in številne, toda prva dva koraka so skupne vsem. Ampak, da bi opredelili DNA fragmente, lahko gel barve, in še veliko drugih obstoječih metod.

vrste

Najbolj neposredno in razširjene metode za odkrivanje mikobakterije lahko vključuje navedeni molekulsko učno metodo genskega DNA. Njegovo bistvo je v tem, da se opredelijo skeniranja verige material specifičnih fragmentov DNK patogenov. Molekularne genetske diagnostični postopki še nimajo bolj učinkovit način, da prizna take bolezni, kot je tuberkuloza. Uporaba polimerazne verižne reakcije (PCR), ste lahko prepričani, da bo prvotni DNK povečalo število kopij na milijon-krat, kar pomeni, da bo ojačitev in bo prikaz rezultatov. Stopnja občutljivosti je zelo visoka - več kot devetdeset-pet odstotkov, kar je glavna prednost te metode.

Preostali del molekularno genetskih metod raziskav o učinkovitosti donosom več kopij dobesedno podvojila, saj je v tem primeru priprava vzorca kaže posebno oligonukleotid sekvenco poveča na sto šestkrat. Tudi kultura diagnoza tuberkuloze respiratornega sistema bistveno znižati občutljivost. To je razlog, zakaj je sodobna medicina temelji na molekularno genetskih metod diagnostike tuberkuloze. Opisana metoda je učinkovita zlasti ko gre za povzročiteljev visoko antigenski variabilnosti, ugotovi, da je drug način, je veliko težje - zahteva posebne hranil medije in gojenje dolgo časa. Biokemični in molekularno genetske metode proizvajajo zelo različno vplivajo na rezultate.

diagnoza tuberkuloze

Marshall PCR diagnoza tuberkuloze najpogosteje uporabljajo tiste DNK sekvence, ki so specifični za vse štiri vrste bolezni. Za dosego tega cilja pogosto uporabljajo oligonukleotidov, ki zaznavajo zaporedje elementov (IS-986, IS-6110), saj ti elementi zaznamujejo izrazito selivske vrste Mycobacterium tuberculosis in vedno prisotna več kopij v genomu. Poleg ekstrakcijo DNA, lahko izvedemo iz čistih kultur in klinično (sputuma pacientov) katero koli drugo primerno metodo. Na primer, obstaja način teleskopa, kjer je liza pufru uporabila na podlagi gvanidin tiocianata in silicijevega dioksida kot nosilnim DNA. Število bolnikov, ki se razlikujejo slabo bakteriološko vsako leto povečuje, zato je v klinični praksi uveljavljenih povsem drugačno raven organizacije: molekularno-genetska metoda študija DNK je bila igra pomembno vlogo pri diagnozi.

Vendar pa moramo priznati, da je ni brez pomanjkljivosti. Metoda PCR je uporaba pogosto prinaša ogromno število lažno pozitivnih rezultatov, in zato je ne le tehnične napake, ampak tudi lastnosti same metode. Poleg tega je z uporabo te metode diagnosticiranja ugotoviti izvedljivost mikobakterije, ki so bile ugotovljene, je preprosto nemogoče. Toda to pomanjkljivost ni najbolj pomembno. Molekularna genetske metode PCR diagnostike prinaša tveganje okužbe mikobakterijske DNA. Zahteve za certificiranje za to razlog, da se za PCR laboratorije namenjen izključno trdo, so potrebne tri ločene prostore. Tehnologija PCR je moderna in zelo zapleteno, saj zahteva uporabo ustrezne opreme in visoko usposobljeno osebje.

bacterioscopy

Ko je treba rezultate diagnoze analize v primerjavi z drugimi podatki: klinični pregled, slikanje, bris mikroskopijo, pridelka in celo odziv na posebno zdravljenje, so zelo pomembni. V tej seriji, študije PCR je le eden od sestavnih delov. Zazna tujek v zgodnji diagnozi lahko najenostavnejši in najhitrejši metode - bakteriološki.

Tam se uporablja pod svetlobnim mikroskopom (barvanje Ziehl-Neelsen) in fluorescenčen (barvanje fluorokromi). Prednost je hitrost bris rezultatov. Vendar pa je njena pomanjkljivost upravičeno velja za omejeno zmogljivost zaradi nizke občutljivosti. Vendar pa je ta metoda daje WHO priporočila kot najbolj ekonomično in zemljo za odkrivanje bolnikov s tuberkulozo. Odkrivanje mikobakterije bakteriološko metodo je napovedni vrednosti in ocenjene izločanje kvantitativno bakterij. Veliko bolj prepričani, da se ukvarjajo s seboj molekularno genetskih raziskovalnih metod tuberkuloze.

kulture

Boljše odkrivanje mikobakterije prepoznati kulturne študije. Setev Patološki material je izdelan v jajčni medij: Mordovsky, Finn II, LJ, in podobno. Modeli odpornosti mikobakterij do zdravil in posredni dokaz o učinkovitosti številnih mikobakterij in njihovih družin in vitro, če uporabljene metode raziskovanja kulture. Da bi povečali delež ločeno mikobakterij inokulacijo patološkega materiala, ki je potekala na več okoljih.

Zadovoljevanje potreb številnih kulturnih, patogenov, vključno z donacijo in tekočin. Uporablja se v tem sistemu in avtomatizirano tip merjenje rasti VANTES. Pridelki treba ugotoviti v inkubator, za največ sedem do osem tednov. V tem času se je pridelek s pomanjkanjem rasti lahko štejejo za negativne. Najbolj učinkovit način za odkrivanje Mycobacterium tuberculosis upoštevati bioloških vzorcev: diagnostičnega materiala okužijo morski prašički, ki so zelo občutljivi na TB.

Nekatere številke

Zanimivo področje študija, ki jo je odprl PCR diagnostiko bil proučiti M. tuberculosis - latentno infekcijo. Sodoben koncept okužbe tuberkuloze kažejo, da je od sto ljudi, ki so bili v stiku z M. tuberculosis, devetdeset in morda je okužena, vendar le deset od njih so aktivno bolezen se razvija. Drugi imajo TB imuniteto, in ker je devetdeset odstotkov primerov okužbe ostaja latentna. Odkriti vzorec je pomagal genetsko metodo molekulsko.

Genetiki rekli, da petinpetdeset odstotkov tistih, katerih pridelek patološko materiala so bili negativni, in osemdeset odstotkov ljudi, okuženih z M. tuberculosis, vendar teče brez radiografsko manifestacije bolezni, prejetih PCR pozitivni odzivi. To je genetska diagnostična metoda pomagala odkriti bolnike ogroženi s študijami PCR, z rezultati svojih analiz (mikroskopije in kultura) so bili negativni, in subklinično okužbo z M. tuberculosis bila prisotna.

sodobna raziskovalna

Ruščina zveza in mikrobiološke laboratorije uporabo pospešenega metodo absolutne koncentracije: nitrat reduktaze aktivnost mikobakterij testirane Griess reagentom. Anti-TB centri uporabiti metodo, ki omogoča določitev odpornosti na zdravila. Ta setev v tekočem mediju, kjer avtomatsko radiometrične in fluorescentne računovodski sistem rast mikobakterije. Takšna analiza se opravi hitro - do dva tedna.

Trenutno se razvijajo nove metode: odpornost na zdravila za mikobakterije se meri na ravni genotipa. Študija molekularnih odpornih genov in pokaže prisotnost v mikobakterije. Ti geni so povezane z odpornostjo na določena zdravila. Na primer, kasa genov, inhA, katG odporna na isoniazida, rpoB gena - rifampicin 16Sp RNA genih in rpsl - streptomicin, emb1 - do ethambutola, gyrA - fluorokinolonsko in tako naprej.

mutacije

Sodobna diagnoza znatno povečala metodo molekularno-genetski ravni za preučevanje DNK in pustimo, da se izvedejo študije velikih mutacij v vsej njihovi spektra. Zdaj vemo, da so najpogostejše mutacije v 516, 526 in 531 kodonoma gena rpoB, in ugotovila, da je odpor do različnih zdravil. Obstaja cela vrsta metod za tipizacijo mikobakterij uporabljajo ne le tradicionalne metode - biokemičnih, bioloških in kulturnih, pa tudi pogosto uporablja sodobne molekularne genske tehnike. Že obstajajo primerni in zagotavljajo pravilen način diagnozo za odkrivanje monogenskih bolezni. Ti temeljijo na raziskavah DNK na točno območju določenega gena. To je običajno zapleten proces, dolgotrajen in drag, vendar podatki, ki je zagotovljena z molekularno genetsko analizo, je veliko bolj natančen in informativen od podatkov vseh drugih analiz.

Že dolgo je znano, da se DNK ne spremeni za vse življenje organizma, da je v vsakem celic z jedri odnakova, kar omogoča, da se z analizo absolutno vse celice v telesu, v kateri koli fazi zorenjem. Poškodovanih gen je mogoče odkriti pred pojavom prvih simptomov do kliničnih znakov bolezni v polnem obsegu, kot tudi pri zdravih heterozigotnih ljudi, vendar imajo mutacijo v genu. Molekularna genetsko dedna bolezen diagnostične metode omogočajo, da razkrije svoje (z neposrednim stikom, DNA diagnostika), kot tudi za analizo ločitve bolezni v družini z dvojno podajo loci DNK (genetskih polimorfizmov), ki so tesno povezane s poškodovanim genom (tj, posredni pristop od DNK diagnostiko). Neposredno ali posredno - vsi DNA diagnostika temelji na metodah identifikacije strogo opredeljen del človeške DNK.

neposredne metode

Neposredne metode diagnosticiranja DNK so, ko je krivec gen dedna bolezen, znana kot dobro znano, in vrste njegovih mutacij. Na primer, primerne neposredne metode v številnih bolezni. To Morbus Huntington (razširitev CTG-ponavlja), fenilketonurija (R408W), cistične fibroze (delF508, večje mutacije) in podobno. Glavna prednost neposredni metodi je diagnostična natančnost stoodstotni lasti, in ni treba narediti analizo DNK ostalo družino. Če se ugotovi, da je mutacija v ustreznem gena, omogoča, da natančno potrdi diagnozo dednosti, določanja genotipa za preostanek obremenjene družine.

Še ena prednost neposrednega diagnoze se šteje, da prepoznajo heterozigotnem nosilec slabih mutacij od sorodnikov in staršev, ki so umrli zaradi bolezni. To še posebej velja za bolezni avtosomno recesivno. Slabosti neposrednih metodah so na voljo tudi. Da bi jih uporabili, morate vedeti natančno lokalizira nenormalno genov, ekson-intron strukturo njenega spektra in njegovih mutacij. Niso vse monogenske bolezni, so danes prejeli takšne informacije. Informativeness neposredne metode ni mogoče šteti za popolno, ker lahko ena in ista gen imajo veliko število patoloških mutacije, ki povzroča razvoj dednih bolezni.

posredne metode

Posredne metode v diagnostiki DNK se uporabljajo na vseh, v drugih primerih, če je poškodovan gen ni opredeljen, vendar le kromosomsko ali če linija diagnoza ni dal rezultata (to se zgodi, če, če obstaja gen kompleks molekularno organizacijo ali veliki meri veliko patološki mutacije). Neposredni metode izvedli analizo ločitve polimorfnih markerjev v alelne družini. najdenih v isti kromosomske regije ali lokus Markerji je tesno povezana z boleznijo in pomenita delecije ali insercije, točka substitucije ponavlja, in njihova polimorfizem je zaradi različne količine celic v bloku.

Najbolj primeren za posredne diagnoza šteje mikrosatelitskimi in minisatellite polimorfizmov, ki se široko porazdeljenih v človeškem genomu. njihova vrednost izražena v visoko vsebnostjo informacije, če poškodbe genetskega razdalja med markerjem in gena ni prevelika. V slednjem primeru je natančnost ocena določena v veliki meri frekvenco rekombinacije med polimorfno označevalca in poškodbami. Neposredni diagnostične metode tudi obvezno predhodno stopnjo alelov frekvencah analiziranega populacijski študiji med bolniki in nosilcev mutacij, plus nujnost določanje verjetnosti rekombinacije neravnovesni in adhezijo označevalcev in mutiranih alelov.

druge metode

Kratke segmenti RNA ali DNA, kot tudi sam gen vizualizirane pod mikroskopsko študija ne more biti zato, da prepoznajo mutacije z molekularno genetske diagnostike potrebnih. Obstaja "Human Genome Project", kot tudi druge napredek v molekularni genetiki močno razširila možnost diagnostiki dednih bolezni - tako pred in po skotitvi. Te metode lahko zagotovijo zgodnje odkrivanje in da predvidevanja poli- in monogenske bolezni, katere prvenec poteka v odrasli dobi. Žal zaradi tehničnih zmožnosti molekularnih genetskih raziskav so včasih izven etičnih mejah, ki so določene v zvezi z dediščino, še posebej, če je diagnoza v adolescenci in otroštva.

Strukturne in številčne kromosomske nenormalnosti so najpogostejši vzroki bolezni in raka, in veliko deformacij. morali kromosomske aberacije treba identificirati, kar je pomembno za družinsko svetovanje - oceniti napovedi, skupaj z reproduktivno tveganja v prihodnje nosečnosti. Analiza kromosom je "zlati standard" za genetske diagnostike, vendar je omejen. Samo metode molekularno genetsko analizo lahko naredimo več, ker tam uporabljajo kloniranje temeljijo na tehnologiji fluorescentne nalepke, ki lahko njihove visoke občutljivosti za prepoznavanje subtilne spremembe, kromosomske, ki jih ni mogoče odkriti klasične citogenetski študij. Te tehnike se vedno bolj širi naše diagnostične zmogljivosti, ko ga preizkusimo, otroci z motnjami v duševnem razvoju, duševne zaostalosti, z mnogimi drugimi dednimi boleznimi.

ugotovitve

To je zelo pomembno za človeštvo so genska struktura in funkcija znanja, tipi variabilnosti, sposobnost za odkrivanje dednih bolezni, ki so se pojavile v zvezi z razvojem molekularne genetike. njegove metode so namenjene študiju molekule DNA - in če je normalno, in če je poškodovan. Priprava sekvenc deoksiribonukleinske kisline nukleotidov (DNA) razteza v stopnjah od prejema vzorcev za identifikacijo posameznih fragmentov. Izolacija genomske DNA iz celic, omejitev (trganje), ojačanja (kloniranje), elektroforezo od fragmentov (ločevanjem električni naboj in molekulsko maso z elektroforezo v agaroznem gelu). Identifikacija specifičnih fragmentov, ki se nahajajo na površini diskretne trak.

Nato dobili v akt posebnih filtrov, skozi katero prehaja vsak fragment hibridizacijo s kloniranimi DNA fragmentov ali sintetičnih radioaktivnih sond je kontrola, ki bo enak vsak testni vzorec. Če spremenite položaj ali dolžino v primerjavi s sondo, če nov fragment ali izginila - vse to kaže, da je analizirala gen doživela prestrukturiranje v zaporedju nukleotidov. Obstaja osem osnovne tehnike molekularne genetske študije: zaporedja (določitev zaporedja DNA), verižne reakcije s polimerazo (povečanje števila zaporedij), priprava oligonukleotidnih znanih genov, kloniranje DNA, produkcija rekombinantnih molekul pridobljene beljakovine zaradi rekombinantnih molekul, ki ustvarja celoto (zbiranje knjižnica) kloniran fragmente, ki so bili pridobljeni z uporabo omejitev.